Монастир, як і близька до нього церква св. Миколая, належали до найстаріших храмів міста. За легендою в монастирі зберігався образ Богородиці, який євангеліст Лука намалював на кипарисовій дошці. Образ імператор Костянтин переніс до своєї столиці з Константинополя разом з посагом візантійської цесарівни Анни він потрапив до Києва. Через триста років зображення Богородиці дісталось Романовичам, а Лев І передав його до монастиря василіан св. Онуфрія. Володислав Опольський, як спадкоємець князів і королівський намісник, забрав образ з монастиря і завіз у своє рідне Опольське князівство. Там 1382 р. на Ясній горі біля Ченстохови він фундував монастир паулінів. В монастирі ікона прославилась дивами. Сьогодні давній княжий образ Матері Божої Ченстоховської цінується як найбільша святиня Польщі.
Перша документальна згадка про монастир відноситься до 1453 р. Через десять років дерев’яні будівлі монастиря обновили на кошти міщанина Степана Дропана. Будівництво мурованої церкви розпочали біля 1550 р. на кошти князя Костянтина Острозького. Одночасно зліва добудували Троїцьку каплицю, звану “малою церквою”. В такому вигляді два храми простояли до 1776 р., коли в процесі перебудови між ними пробили прохід. 1820 р. домурували вівтарну частину церкви з двома бічними захристіями. Будівництво святині тривало біля чотирьох сотень років і завершилось 1902 р., коли до основного об’єму храму прибудували праву каплицю. Тоді ж встановили новий іконостас з іконами Модеста Сосенка.
В монастирі перебувало біля 10 ченців. Давні монастирські будівлі з дерева в XVI ст. поступились місцем мурованим. Біля монастиря на цвинтарі, що існував ще з княжих часів, поховали 1583 р. першодрукаря Івана Федорова. Федоров чи Федорович свій “Апостол” надрукував 1574 р. в друкарні, що до 1615 р. містилась в монастирі. В XVII ст. монастир пережив важкі випробовування, його довелось тричі відновлювати.
Старі будівлі знищила пожежа 1623 р., боєві дії 1655, 1672 рр. В середині століття розпочалась перебудова монастиря, якому для безпеки надали оборонного характеру. Після вирубання старого саду звели оборонну вежу з гарматами й пушкарями, котру надбудували 1681 р. ще одним ярусом з дерева. Через десятиліття на заміну старій монастирській огорожі з дерева прийшов мур з каміння і цегли з ровом і двома вежами від Замкової вулиці. При його зведенні використовували навіть старі могильні плити з цвинтаря. Монастир перебував під опікою і у власності Ставропігійського братства, в залежності від котрого було “молодше” Святоонуфрієвське братство, закладене 1633 р. Братство утримувало монастир, монастирський шпиталь – притулок для старців, куди хворих приймали за окрему плату; школу для незаможних хлопчиків; призначало ігумена. Львівський єпископ Гедеон Балабан, котрий неприхильно ставився до Ставропігійського братства через втручання світських осіб у релігійні справи, 1590 р. спробував захопити монастир, але після втручання київського митрополита змушений був визнати права братства. Протягом XVII ст. за володіння монастирем точилась боротьба поміж єпископами, що прийняли унію, та братством. Вона завершилась лише 1708 р., коли братство признало Берестейську унію з умовою безпосереднього підпорядкування римському престолу. Вже в 1820 р. було перебудовано вхідну вежу монастиря, надбудовано на один поверх монастирські будівлі. Наприкінці XIX ст., коли українську громаду Львова роздирали протиріччя москвофілів і народовців, безслідно пропала надгробна плита Івана Федорова, вмурована до того в монастирську підлогу. В приміщенні церкви 1977 р. відкрили Музей історії книгодрукування, котрий існував до повернення будівель василіанам на початку 1990-х рр. На межі ХХ-ХХІ ст. ченці розпочали перебудову будівель монастиря.